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A Pneumocystis é uma infeção oportunista que afecta principalmente doentes imaturos. A introdução da biologia molecular no diagnóstico da pneumocistose melhorou a sensibilidade da deteção do agente patogénico. O objetivo do nosso estudo é mostrar a contribuição da PCR em tempo real em comparação com as técnicas de coloração. O nosso estudo é retrospetivo (janeiro de 2022-agosto de 2023) e inclui 6 casos de pneumocistose. Em 4 casos (67%), foram detectadas co-infecções com Pneumocystis jirovecii em associação com VIH, CMV e SARS-CoV-2. A co-infeção com Mycobacterium tuberculosis foi observada em 1 caso (17%). A coloração convencional com MGG e Musto-modificado Gomori Grocott foi negativa em todos os casos. No entanto, a análise por PCR em tempo real apresentou resultados positivos para todas as amostras, demonstrando uma sensibilidade de 100%. Os níveis de carga parasitária variaram entre 10 e106 cópias/mL. A PCR quantitativa é uma técnica altamente sensível, com menor risco de contaminação, e ajuda os médicos a distinguir entre colonização e infeção.