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La separazione di composti altamente molecolari è molto difficile, se possibile, in condizioni isocratiche ed è necessaria un'eluizione a gradiente. La teoria dell'eluizione a gradiente per le piccole molecole è ben consolidata; tuttavia, le sue applicazioni alle separazioni a gradiente in fase inversa di biopolimeri non sono semplici a causa di problemi specifici, come la diffusione lenta, l'accessibilità limitata della fase stazionaria per le molecole più grandi o i possibili cambiamenti di conformazione del campione durante l'eluizione. La cromatografia liquida ad alte prestazioni è stata utilizzata per studiare il comportamento cromatografico in fase inversa di diverse proteine. Utilizzando un sistema acqua/solvente organico/acido trifluoroacetico è stata esaminata l'influenza dei parametri sperimentali; i risultati cromatografici ottenuti da diversi supporti per fasi stazionarie sono risultati comparabili.