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Withania somnifera Dunal (Ashwagandha) es una planta medicinal india con importantes propiedades farmacológicas como efectos adaptogénicos, antioxidantes, hipoglucémicos y antiictus. Varios de sus quimiotipos incluyen NMITLI-101, NMITLI-118, NMITLI-128. El presente trabajo elabora estudios fitoquímicos y analíticos sobre NMITLI118RT+ un fármaco candidato bajo el paraguas del CSIR (derivado de un nuevo quimiotipo de W. somnifera). Aquí reportamos el desarrollo, validación y aplicaciones de un método HPLC isocrático simple, rápido y confiable para la cuantificación de Withanolide A en NMITLI118RT+ en una columna CN utilizando gliclazida como estándar interno que podría detectar Withanolide A en aproximadamente 3.8 min y gliclazida (estándar interno) en aproximadamente 4.8 min con un rango de linealidad de 2-20 µg/mL. Un segundo método reporta aquí el desarrollo y validación de un método isocrático simple para la estimación simultánea de Withanolide A y Withanone (marcadores de lactonas sesquiterpénicas) establecido en una columna C-18; 3µ que pudo detectar Withanolide A y Withanone a tiempos de retención de alrededor de 20.7 min y 21.6 min respectivamente en el rango de linealidad de 2-50 µg/mL para ambos.