Ziel der Arbeit war es, Gene für die nicht-ribosomale Peptidsynthese in O. olearius zu isolieren und zu charakterisieren. Bisher wurden in Basidiomyceten nur zwei NRPSGene mit ihren Produkten in dem Heterobasidiomyceten U. maydis beschrieben.
Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals drei nicht-ribosomale Peptid Synthetase (NRPS)-Gene in einem Homobasidiomyceten identifiziert werden.
Neben zahlreichen konventionellen Genfindungsstrategien führte die Mitarbeit an drei GST-Projekten zur Identifizierung von NRPS-Genfragmenten. Dabei wurden für das dritte GST-Projekt zwei Fosmidbanken mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese konstruiert, die zudem für ein "chromosome walking" über ein neu etabliertes PCR-"screening" eingesetzt wurden.
Das NRPS-Gen fso1 (16,3 kb) hatte bei Sequenzvergleichen die höchsten Homologien zu Siderophorsynthetasen. Die modulare Struktur (ATC-ATC-ATC-TCTC) ist identisch mit der Ferricrocin-Synthetase SidC aus A. nidulans und der Ferrichrom A-Synthetase Fer3 aus U. maydis. In Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass O. olearius Ferrichrom A produziert. Um das NRPS-Gen fso1 konnte ein komplettes etwa 22 kb umfassendes Gencluster identifiziert werden.
Dieses Cluster enthält alle für die Ferrichrom A-Synthese essentiellen Enzyme, eine - L-Ornithin-N5-Monooxygenase (omo1, 2,1 kb) für die Hydroxylierung des L-Ornithins zum N5-Hydroxyornithin und eine Acyltransferase (ato1, 1,3 kb) für die Acylierung des N5-Hydroxyornithins zum N5-Methylglutaconyl-N5-Hydroxyornithin. Erstmals wurde in O. olearius nachgewiesen, dass alle Siderophorbiosynthese-Gene in einem Cluster organisiert sind. Mittels cDNA-Analysen konnte für fso1 gezeigt werden, dass der orf in 48 Positionen durch Introns unterbrochen wird. Das ist die bisher höchste Anzahl von beschriebenen Introns in einem NRPS-Gen. Ein weiteres Indiz, dass die Gene des fso1-Genclusters für die Biosynthese des Ferrichrom A zuständig sind, konnte durch Expressionsanalysen via Northern-Blot und "real-time" PCR gezeigt werden. Für die Gene fso1 und omo1 konnte unter Eisenmangelbedingungen eine 60- bzw. 10-fache Überexpression gezeigt werden. Neben den hohen Sequenzhomologien sprechen alle diese Punkte für die Vermutung, dass es sich bei Fso1 um die Ferrichrom A-Synthetase aus O. olearius handelt.
Des Weiteren konnte ein zweites potentielles Gencluster (bisher 24 kb) identifiziert werden. Neben dem putativen NRPS-Gen pso3 (15,7 kb) konnte dabei ein Gen, das für eine mögliche Aminotransferase (amo1, 1,7 kb) kodiert und Teile eines ABC- und eines Glyceroltransporter-Gens identifiziert werden. In der modularen Struktur der NRPS Pso3 (CAT-ATEC-ATC-ATE) konnten die bisher ersten Epimerisierungs-Domänen bei einem Basidiomyceten beschrieben werden. Zudem kann anhand der auffälligen Struktur eine nicht lineare Synthesestrategie vermutet werden, die bei Pilzen bisher noch nicht beschrieben ist. Die höchsten Homologien bestanden bei pso3 im Gegensatz zu fso1 hauptsächlich zu bakteriellen NRPS.
Das dritte NRPS-Gen (pso4) wurde in Teilen sequenziert. Mit cDNA-Analysen wurde gezeigt, dass der orf von ca. 5 kb in nur drei Positionen durch Introns unterbrochen wird und das Gen unter Standardbedingungen exprimiert wird. Die modulare Struktur (C-ATC) wurde ähnlich wie bei pso3 bisher in Pilzen noch nicht beschrieben.
Durch die Aufklärung der strukturellen Basis der hier beschriebenen NRPS konnte die Grundlage für die Identifizierung neuer Gene dieses Typs in Homobasidiomyceten geschaffen werden. Durch die Analyse der einzelnen Domänen konnten starke Homologien zu bakteriellen (pso3) und zu pilzlichen (fso1) NRPS aufgezeigt werden. Die C-Domänen unterscheiden sich in allen identifizierten NRPS in den konservierten Bereichen deutlich von den bakteriellen Motiven. Außerdem wurde deutlich, dass die konservierten Bereiche von NRPS innerhalb einer Art sehr heterogen sein können.
Mit Hilfe aller bisher charakterisierten Gene aus O. olearius konnte gezeigt werden, dass 5'- und 3'-Spleißstellen große Ähnlichkeiten zu denen anderer Pilze haben, die Transkriptionsinitiationssequen
Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals drei nicht-ribosomale Peptid Synthetase (NRPS)-Gene in einem Homobasidiomyceten identifiziert werden.
Neben zahlreichen konventionellen Genfindungsstrategien führte die Mitarbeit an drei GST-Projekten zur Identifizierung von NRPS-Genfragmenten. Dabei wurden für das dritte GST-Projekt zwei Fosmidbanken mit Hilfe einer Pulsfeldgelelektrophorese konstruiert, die zudem für ein "chromosome walking" über ein neu etabliertes PCR-"screening" eingesetzt wurden.
Das NRPS-Gen fso1 (16,3 kb) hatte bei Sequenzvergleichen die höchsten Homologien zu Siderophorsynthetasen. Die modulare Struktur (ATC-ATC-ATC-TCTC) ist identisch mit der Ferricrocin-Synthetase SidC aus A. nidulans und der Ferrichrom A-Synthetase Fer3 aus U. maydis. In Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass O. olearius Ferrichrom A produziert. Um das NRPS-Gen fso1 konnte ein komplettes etwa 22 kb umfassendes Gencluster identifiziert werden.
Dieses Cluster enthält alle für die Ferrichrom A-Synthese essentiellen Enzyme, eine - L-Ornithin-N5-Monooxygenase (omo1, 2,1 kb) für die Hydroxylierung des L-Ornithins zum N5-Hydroxyornithin und eine Acyltransferase (ato1, 1,3 kb) für die Acylierung des N5-Hydroxyornithins zum N5-Methylglutaconyl-N5-Hydroxyornithin. Erstmals wurde in O. olearius nachgewiesen, dass alle Siderophorbiosynthese-Gene in einem Cluster organisiert sind. Mittels cDNA-Analysen konnte für fso1 gezeigt werden, dass der orf in 48 Positionen durch Introns unterbrochen wird. Das ist die bisher höchste Anzahl von beschriebenen Introns in einem NRPS-Gen. Ein weiteres Indiz, dass die Gene des fso1-Genclusters für die Biosynthese des Ferrichrom A zuständig sind, konnte durch Expressionsanalysen via Northern-Blot und "real-time" PCR gezeigt werden. Für die Gene fso1 und omo1 konnte unter Eisenmangelbedingungen eine 60- bzw. 10-fache Überexpression gezeigt werden. Neben den hohen Sequenzhomologien sprechen alle diese Punkte für die Vermutung, dass es sich bei Fso1 um die Ferrichrom A-Synthetase aus O. olearius handelt.
Des Weiteren konnte ein zweites potentielles Gencluster (bisher 24 kb) identifiziert werden. Neben dem putativen NRPS-Gen pso3 (15,7 kb) konnte dabei ein Gen, das für eine mögliche Aminotransferase (amo1, 1,7 kb) kodiert und Teile eines ABC- und eines Glyceroltransporter-Gens identifiziert werden. In der modularen Struktur der NRPS Pso3 (CAT-ATEC-ATC-ATE) konnten die bisher ersten Epimerisierungs-Domänen bei einem Basidiomyceten beschrieben werden. Zudem kann anhand der auffälligen Struktur eine nicht lineare Synthesestrategie vermutet werden, die bei Pilzen bisher noch nicht beschrieben ist. Die höchsten Homologien bestanden bei pso3 im Gegensatz zu fso1 hauptsächlich zu bakteriellen NRPS.
Das dritte NRPS-Gen (pso4) wurde in Teilen sequenziert. Mit cDNA-Analysen wurde gezeigt, dass der orf von ca. 5 kb in nur drei Positionen durch Introns unterbrochen wird und das Gen unter Standardbedingungen exprimiert wird. Die modulare Struktur (C-ATC) wurde ähnlich wie bei pso3 bisher in Pilzen noch nicht beschrieben.
Durch die Aufklärung der strukturellen Basis der hier beschriebenen NRPS konnte die Grundlage für die Identifizierung neuer Gene dieses Typs in Homobasidiomyceten geschaffen werden. Durch die Analyse der einzelnen Domänen konnten starke Homologien zu bakteriellen (pso3) und zu pilzlichen (fso1) NRPS aufgezeigt werden. Die C-Domänen unterscheiden sich in allen identifizierten NRPS in den konservierten Bereichen deutlich von den bakteriellen Motiven. Außerdem wurde deutlich, dass die konservierten Bereiche von NRPS innerhalb einer Art sehr heterogen sein können.
Mit Hilfe aller bisher charakterisierten Gene aus O. olearius konnte gezeigt werden, dass 5'- und 3'-Spleißstellen große Ähnlichkeiten zu denen anderer Pilze haben, die Transkriptionsinitiationssequen