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La separación de compuestos de alto peso molecular es muy difícil, si es que es posible, en condiciones isocráticas, por lo que es necesaria la elución en gradiente. La teoría de la elución en gradiente para moléculas pequeñas está bien establecida; sin embargo, sus aplicaciones a las separaciones en gradiente en fase inversa de biopolímeros no son sencillas debido a problemas específicos, como la difusión lenta, la accesibilidad limitada de la fase estacionaria para moléculas más grandes o los posibles cambios de conformación de la muestra durante la elución. La cromatografía líquida de alta resolución se ha utilizado para investigar el comportamiento cromatográfico en fase inversa de diferentes proteínas. Utilizando un sistema de agua/solvente orgánico/ácido trifluoroacético se examinó la influencia de los parámetros experimentales; los resultados cromatográficos de los distintos soportes de las fases estacionarias fueron comparables.